紫外交联仪实验原理和步骤

    紫外交联仪的主要用途为在膜上交联核酸,其是一种254mm紫外辐射系统,其有很多用途,UV灭菌消除PCR污染、嘧啶二聚体产生的部分限制性内切酶消化、RecA突变筛选以及琼脂糖凝胶中DNA的切割等亦是其用途。紫外交联仪其的应用价值也体现在聚合物紫外处理和紫外灭菌等方面。以下为紫外交联实验原理和步骤。


原理:

和非取代的DNA相比较,含有如溴脱氧尿苷胸苷卤代物的DNA对于紫外线诱导的交联有着更高的敏感性。


仪器:

1、紫外透射仪 2、水浴锅  3、 圆底0.5 mL 4、螺旋盖的小瓶  5、DEAE膜  4.jpg


试剂:


14C标记的蛋白质分子质量标记物、Fluor、SDS样品缓冲液×2、1U 微球菌核酸酶、DNA酶I 、CaCl2 0.5 mol/L、大分子载体DNA、经缓冲的含有DNA结合蛋白的提取液、TE缓冲液、100%乙醇、乙酸铵、25U 大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、二硫苏糖醇 0.lmol/L、dNTP BrdU 溶液×50、[α32P] dCTP 3000 Ci mmol、10×与1×限制性内切核酸酶缓冲液以及M13通用引物17bp。


步骤

1、混合10μL含有高亲和性蛋白结合位点的目的序列的单链M13载体和等摩尔的17 bp M13通用引物,使用1×限制性内切核酸酶缓冲液调节终体积到100μL。在90摄氏度下加热5分钟。在室温下冷却、


2、在杂交混合物中加入Klenow 酶 5μL、水7μL、10×限制性内切核酸酶缓冲液7.5μL、0.1 mol/L 二硫苏糖醇1.75μL、50× dNTP/BrdU 溶液 3.5μL、[α32P] dCTP50μ等反应物,在16摄氏度下温浴90分钟。


3、在68摄氏度下加热10分钟,将Klenow 酶灭活。


4、使用40U限制性内切核酸酶在合适条件下消化,紫外交联仪使得20600 bp的DNA片段产生。


5、将乙酸铵添加到0.3 mol/L,DNA使用2倍体积的100%乙醇进行沉淀,在TE缓冲液中重悬。


6、电泳在含有0.5μg/mL溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行。所要的DNA片段使用DEAE膜进行分离。


7、BrdU取代的DNA片段的特异活性使用闪烁计数器进行检测,DNA的浓度的估计采用溴化乙锭点迹定量法。能够采用迁移率变动DNA结合分析法来检测探针的完整性和功能。


8、将下列结合反应建立于1.5 mL圆底小瓶中:将10-20μg DNA 载体、经缓冲的含有结合蛋白的提取液以及105cpm均衡标记的探针混合,调节总体积到50μL。瓶口使用塑料薄膜封住,固定再采用Parafilm膜加封。


9、在试管架上放上小瓶,于正上方5厘米处使用倒置的紫外透射灯照射1个小时。


10、将1U微球菌核酸酶、DNA 酶 I 4μg、0.5 mol/L CaCl2 1μL等反应物加入到各结合反应管中,在37摄氏度下消化半个小时。


11、在反应混合物中加入等体积的2×SDS样品缓冲液,在100摄氏度中煮沸5分钟。


12、样品的电泳在适当浓度的不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行。


13、完成电泳之后,将凝胶前沿的染料切去。


14、干胶,使用增感屏放射自显影13日,来对交联的蛋白质进行观测。


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